La CITOMETRÍA DE FLUJO vale su peso en oro porque permite analizar muy rápidamente (un millón de células en unos 10 minutos😮) las células presentes en una muestra. Además de contarlas, permite conocer una serie de características relacionadas con el tamaño y la complejidad interna de cada una de ellas. Por la cantidad de aplicaciones que tiene en el campo de la neurociencia, el citómetro de flujo es un equipo indispensable para continuar avanzando en el conocimiento del sistema nervioso.
El citómetro de flujo es uno de los equipos estrella en cualquier laboratorio de neurociencia, porque incorpora una tecnología que permite medir y cuantificar propiedades fenotípicas, bioquímicas o moleculares tanto de células individuales como de otras partículas, biológicas o no. Una variante común de esta técnica permite además separar físicamente células o partículas según sus propiedades, lo que permite, por ejemplo, purificar poblaciones de interés.
- Muy rápida: analiza y cuenta decenas de millares de células o partículas en pocos segundos (un promedio de más de 2000 por segundo [2]).
- Muy potente: analiza simultáneamente más de una decena de parámetros cualitativos y cuantitativos (intrínsecos y extrínsecos [3]) de cada una de las células o partículas presentes en una población celular heterogénea. e cualquier célula o partícula suspendida desde 0,2 hasta 150 micras
- Muy versátil: además de contar las células, permite obtener información relacionada con el tamaño y la complejidad interna de cada célula. Utilizando anticuerpos con un marcador fluorescente también se conoce el grado de expresión de determinadas proteínas de la superficie celular.
- Como cualquier técnica puntera, la citometría de flujo necesita contar con personal muy cualificado para su manejo y tiene un coste elevado, tanto en términos de pretratamiento, tinción y preparación de muestras, como de calibración.
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Un poco de historia
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- Teniendo en cuenta que la citometría de flujo es una tecnología compleja que se basa en la combinación de diferentes principios físicos, químicos, eléctricos y ópticos, es difícil establecer su punto de partida. Sin embargo, se considera que el primer prototipo de citómetro de flujo fue el dispositivo fotoeléctrico diseñado en 1934 por el bacteriólogo Andrew Moldovan para contar células individuales que se movían a través de un tubo capilar iluminado colocado en una platina de microscopio. Aunque el diseño se publicó en la revista Science, el dispositivo nunca llegó a construirse.
- Durante la Segunda Guerra Mundial, el interés del ejército de EE. UU. por desarrollar un sistema que detectara rápidamente agentes biológicos bacterianos marcó otro hito importante en la historia de la citometría de flujo. Fueron Gucker y O’Konsi quienes, en 1947, desarrollaron el primer citómetro para la detección de bacterias y esporas en aerosoles utilizando un faro Ford como fuente de iluminación y un tubo fotomultiplicador para amplificar la señal de luz incandescente.
- Algunos años más tarde, en 1953, el ingeniero eléctrico Wallace H. Coulter enunció el llamado «principio de Coulter», que viene a decir que las partículas que pasan a través de un orificio en presencia de una corriente eléctrica producen un cambio en la impedancia que es proporcional al volumen de la partícula.
Fuente: https://es.wikipedia.org/wiki/Principio_Coulter#/media/Archivo:Coulter_geometries.png - Mack Fulwyler inventó en 1963 el primer citómetro separador (o cell sorter) en el Laboratorio Nacional de los Álamos (EE. UU.) al combinar el análisis automatizado del tamaño celular con una nueva tecnología de impresoras de chorro de inyección de tinta.
- En 1967, Louis Kametsky (de IBM) diseñó un dispositivo espectrofotométrico para clasificar células cervicales basándose en múltiples propiedades espectrofotométricas a velocidades superiores a 500 células por segundo (los citómetros actuales pueden trabajar a velocidades de 70000 eventos por segundo).
- En 1978 Wolfgang Göde desarrolló el primer citómetro de flujo basado en fluorescencia en la Universidad de Münster (Alemania). A principios de la década de los 70 Howard Shapiro y Block Instruments diseñaron una serie de citómetros de flujo con un sistema multihaz de láseres que permitían medir múltiples fluorescencias de forma simultánea. Shapiro publicó la que sigue siendo una de las «biblias» de la citometría: «Practical Flow Cytometry».
- De forma paralela, un grupo de la Universidad de Standford (EE. UU.) dirigido por Len Herzenberg desarrolló y patentó el primer citómetro separador activado por fluorescencia (FACS) a finales de los años 1960. Este nuevo método para separar células individuales en función de sus características específicas de dispersión de luz y fluorescencia revolucionó la investigación en inmunología, hematología y oncología.
- En 1974 Becton Dickinson (ahora BD Biosciences) obtuvo la licencia de la tecnología FACS de la Universidad de Stanford e introdujo el primer citómetro FACS comercial.
- No podemos olvidar lo que supuso para el desarrollo exponencial de la citometría de flujo en la investigación biomédica el trabajo de George Köhler y César Milstein, que en 1975 fusionaron por primera vez linfocitos con células de un mieloma para obtener un hibridoma una línea celular inmortal capaz de producir anticuerpos específicos (monoclonales). Un trabajo por el que recibieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1984, junto a Niels K. Jerne.
Principios de funcionamiento
Básicamente, el citómetro de flujo mide las propiedades de absorción y dispersión de la luz por la célula o partícula subcelular, así como la fluorescencia emitida por los fluorocromos unidos a componentes celulares de interés, e inducida por una iluminación apropiada. La mayor o menor dispersión de luz según diferentes ángulos permite cuantificar el tamaño relativo y la complejidad (morfología de la superficie, granulosidad interna) de la célula.
La teoría de fluidos es la que fundamenta el sistema hidrodinámico que crea el flujo laminar que obliga a las células o partículas a fluir en una fila única en el centro de la corriente (enfoque hidrodinámico) hasta conducirlas al punto de interrogación, donde el láser las excitará para generar una variedad de potenciales de excitación.
Llegadas al punto de interrogación, el conteo de células o partículas se basa en el ya mencionado principio de Coulter.
Componentes básicos de un citómetro de flujo
- El SISTEMA DE FLUIDOS lleva las células o partículas hasta el punto de interrogación. Consta de una cámara de flujo, donde se orienta el fluir de las células o partículas para conseguir que pasen de una en una por el llamado punto de interrogación.
- Algunos citómetros incorporan una unidad de separación (o módulo cell sorter), de modo que además de analizar las células, permiten separar físicamente subpoblaciones de una muestra en función de sus parámetros morfológicos y de fluorescencia. En ocasiones la separación es inmunomagnética (se revisten microesferas magnetizables con anticuerpos monoclonales que marcan las células que se desea analizar).
Separación inmunomagnética (adaptado de inmunosalud.net) - En el Instituto Cajal esto nos permite, por ejemplo, separar en un tubo las neuronas que expresan orexina del hipocampo de un ratón aislándolas del resto de células del cerebro del animal. Esto, unido al desarrollo de las ciencias ómicas y de los estudios en «célula única» (single cell) hacen que el módulo de separación y en concreto la tecnología de célula única sea una aplicación puntera dentro del campo de la neurociencia.
El SISTEMA ÓPTICO ilumina las células o partículas y gracias al conjunto de filtros y espejos la luz emitida llega a los detectores. La fuente de luz es generalmente un rayo láser (luz altamente direccionada, monocromática, coherente e intensa que se concentra en un haz estrecho). Actualmente suele ser un láser de ion argón. El sistema óptico de excitación se completa con lentes, espejos y filtros que enfocan el haz de luz para iluminar la muestra y descomponer la emisión de fluorescencia en sus componentes individuales.
- El SISTEMA ELECTRÓNICO se encarga de registrar y procesar la información gracias a una serie de fotomultiplicadores y convertidores analógicos/digitales que detectan y convierten las señales luminosas en impulsos eléctricos, y estos en señales digitales. Un ordenador asegura el control instrumental del citómetro de flujo y el almacenamiento y análisis de los datos en tiempo real o en modo de matriz de datos.
- Los datos generados por los citómetros de flujo pueden representarse en relación a una variable, en forma de histograma, o en gráficos de puntos (dot-plot) de dos dimensiones y dos o más variables, o incluso en gráficos tridimensionales.
Perspectivas de futuroCITOMETRÍA DE FLUJO ESPECTRAL
En lugar de evaluar la emisión máxima de cada fluoróforo, la citometría de flujo espectral utiliza una serie de detectores para medir el espectro completo, que posteriormente se separará mediante un algoritmo matemático. Esto permite usar fluoróforos con espectros muy similares casi superpuestos para aumentar el número de parámetros analizados en cada experimento.
CITOMETRÍA CLÁSICA POLICROMÁTICA
FUENTE: http://cyto.purdue.edu/en https://www.future-science.com/doi/10.2144/btn-2022-0005
a) Cada detector recoge únicamente el máximo de emisión del fluoróforo.b) El propio fenómeno físico de la fluorescencia hace que los espectros de emisión se superpongan y la señal se «cuele» en otros detectores
c) Solo se recoge la señal de fluorescencia de la longitud de onda determinada por el filtro que estemos utilizando, de modo que el resto de la señal se pierde.
CITOMETRÍA ESPECTRAL
Recoge y analiza la fluorescencia emitida por el fluoróforo a lo largo de todo el espectro. Esta marca espectral es única (comparable a una huella digital en un ser humano) e identifica a un único fluoróforo. Actualmente solo se pueden analizar en un citómetro espectral hasta 20 colores, pero es probable que en pocos años evolucionen para permitirnos medir simultáneamente varios cientos de parámetros en cada célula.
FUENTE: http://cyto.purdue.edu/en https://www.future-science.com/doi/10.2144/btn-2022-0005
CITOMETRÍA DE MASASEs una combinación de la citometría de flujo con la espectrometría de masas. En lugar de anticuerpos marcados con fluoróforos, esta técnica utiliza anticuerpos marcados con iones de metales pesados.
CITOMETRÍA DE IMÁGENES
Esta técnica combina la citometría con la microscopía de fluorescencia y permite evaluar la morfología de las células (es una de las grandes limitaciones de la citometría clásica) y también permite visualizar la coexpresión de proteínas, la unión celular, la translocación celular de proteínas, las sinapsis de células inmunitarias…Como muestra la imagen, simplemente pasando la sangre por el citómetro —sin utilizar marcadores fluorescentes—, podemos diferenciar entre linfocitos, monocitos y granulocitos analizando su tamaño y complejidad.
Adaptado de MIT y EMBL
Estrategia de «gating» para analizar la proporción de linfocitos CD8 efectores de memoria con relación a otras subpoblaciones linfocitarias en el cerebro de ratón.
Aplicaciones de la citometría de flujoINMUNOFENOTIPADO = identificar y cuantificar de distintas poblaciones celulares según la distinta expresión de ciertos marcadores de superficie o intracelulares- Identificar poblaciones celulares mediante
marcaje de antígenos intra o extracelulares
- Estudiar la viabilidad celular mediante la
utilización de colorantes vitales
- Medir la apoptosis celular mediante la
utilización de distintas técnicas (Anexina-V/Ioduro de Propidio, TUNEL,
determinación del potencial de membrana mitocondrial, detección de pico
sub-G0, etc.)
- Estudiar el estrés oxidativo mediante el empleo
de sondas fluorescentes
- Estudiar las distintas fases del ciclo celular
- Determinar el índice proliferativo celular
mediante la utilización de análogos de nucleósidos marcados (BrdU)
- Estudiar la expresión génica guiados por
proteínas fluorescentes (GFP, YFP…)
- Estudiar la señalización intracelular
- Cuantificar las citoquinas y otras proteínas
solubles
- Estudiar la movilización de Ca2+ intracelular
- Separación celular (sorting)
Ya lo veis, la citometría de flujo tiene un futuro tan resplandeciente como el palo de oros que representa, principalmente porque es la única tecnología que permite análisis globales y multiparamétricos de células individuales.
¿TE HA PICADO LA CURIOSIDAD Y QUIERES SABER MÁS?
Notas:
[1] El citómetro de flujo del Instituto Cajal analiza células o partículas comprendidas entre 0,5 y 100 micrómetros.
[2] Wikipedia, entrada Citometría de flujo https://es.wikipedia.org/wiki/Citometr%C3%ADa_de_flujo
[3] Parámetros intrínsecos, como tamaño, superficie, granularidad del interior de la célula, autofluorescencia (una propiedad intrínseca de ciertas moléculas —denominadas fluoróforos— que se caracterizan por la emisión transitoria de luz cuando son estimuladas por una fuente exógena de una longitud de onda más corta —más energética—).
Parámetros extrínsecos, como contenido en y composición de ácidos nucleicos (ADN y ARN), estructura de la cromatina, proteínas, grupos sulfhídricos (-SH), antígenos, lectinas, sitios de unión, componentes del citoesqueleto, estructura de las membranas, actividad enzimática, endocitosis, carga superficial, receptores, calcio libre y ligado, apoptosis, necrosis celular, pH, farmacocinética.
Otras fuentes:
PAUL ROBINSON, J. (2022). Flow cytometry: past and future. Biotechniques Vol. 72, no. 4
https://www.future-science.com/doi/10.2144/btn-2022-0005
El gen curioso. Entrada Citometría de flujo. https://www.elgencurioso.com/diccionario/citometria-de-flujo/
Vídeos:
Flow Cytometry Animation (EN INGLÉS), MIT https://www.youtube.com/watch?v=EQXPJ7eeesQ
Rodrigo Blanco y Dr. Corell Almuzara para la Facultad de Medicina de la Universidad de Valladolid https://www.youtube.com/watch?v=gEdZvuDrWo4
Paula Reyes https://www.youtube.com/watch?v=RfDMmxS8Zik
Malte Paulsen, Flow Cytometry introduction https://www.youtube.com/watch?v=W1BFeiDwqnk
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