La REACCIÓN en CADENA de la POLIMERASA, o PCR por sus siglas inglesas, era una técnica desconocida para los no especialistas en bioquímica o biomedicina hasta que la epidemia del SARS CoV-2 la puso en boca de todos. Pero la PCR no solo sirve para saber si estamos o no infectados por el coronavirus que provoca la COVID-19, porque es una técnica potentísima. Gracias al termociclador, que permite la magia del trabajo de la enzima ADN polimerasa, la PCR desnaturaliza, hibrida y elonga para replicar el mínimo fragmento de material genético del organismo que queramos estudiar.
La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR por sus siglas inglesas (Polymerase Chain Reaction), es
una técnica utilizada en biología molecular que permite conseguir en poco tiempo una gran
cantidad de copias de un fragmento de ADN, partiendo de una cantidad ínfima de
esta biomolécula.
El ADN es uno de los dos tipos que existen de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos son el nombre que reciben las biomoléculas que guardan la codificación genética de cualquier organismo vivo: son el «manual de instrucciones» donde, con un código de cinco bases (adenosina , citosina, guanosina, timina y uracilo) se «escriben» y especifican las características que tendrá el ser vivo. Pueden ser de dos tipos:
- Ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena [1] y característico de animales (incluidos los seres humanos), vegetales, bacterias y algunos virus (como el de la hepatitis B o el papiloma humano)
- Ácido ribonucleico (ARN) de cadena simple y característico de ciertos virus (como el famoso SARS CoV-2 que provoca la COVID-19, entre otros muchos)
Cuando las células de un organismo vivo se dividen, su material genético debe duplicarse de modo que cada célula hija herede una copia idéntica del material genético de la célula madre. Este proceso se denomina mitosis.
Para replicar el material genético y obtener dos copias idénticas, los seres vivos cuentan con la actividad enzimática de unas moléculas muy particulares: las ADN polimerasas. La técnica de la PCR se
basa en esta actividad enzimática que sucede de forma natural en las células vivas. Como ocurre in vivo, in vitro se emplean ADN polimerasas termoestables (resistentes a temperaturas altas) capaces de «fotocopiar» un fragmento de ADN del que deseamos obtener una gran cantidad de copias igualitas.
Descripción de la técnica
La PCR consiste en la repetición de un ciclo integrador de tres etapas, cada una de las cuales se caracteriza por una temperatura y una duración específica.
Por eso, para llevar a cabo una PCR es imprescindible regular perfectamente las condiciones de temperatura en la que se producirán las sucesivas etapas y establecer con precisión la duración de cada una de ellas. Estas son las funciones del TERMOCICLADOR, que gracias a la posibilidad de programar la modificación de la temperatura de la solución en varias ocasiones y sus tiempos, permite realizar esta técnica en muchísimo menos tiempo, ya que para realizarla, se debe modificar la temperatura de la solución en varias ocasiones.
Además del termociclador, para llevar a cabo una PCR necesitamos los siguientes elementos:
- El ADN molde o fragmento
de ADN que queremos amplificar mediante la PCR.
- Nucleótidos (desoxirribonucleótidos-trifosfato): se trata de los cuatro tipos de bases nitrogenadas que forman el armazón del ADN (adenina, guanina, citosina y timina).
- Cebadores (en inglés, primers). Se trata de oligonucleótidos (secuencias cortas de ADN con entre 15 y 30 nucleótidos) que se unen a la molécula de ADN molde y sirven como punto de inicio para que la Taq polimerasa comience la síntesis de ADN. En la PCR necesitamos dos cebadores, cada uno complementario a una cadena del ADN que buscamos amplificar (en el extremo 3'). Son los que acotarán la región del ADN que se va a amplificar.
- ADN polimerasas: las reinas de esta técnica bioquímica. En la PCR se pueden utilizar diferentes ADN polimerasas, obtenidas de varios organismos. Sin embargo, la más efectiva y resistente a altas temperaturas procede de una bacteria y se llama Polimerasa Taq.
- Iones divalentes de magnesio. Se emplean como cofactores de la polimerasa. Estos cationes son esenciales para la función de la ADN polimerasa. Normalmente se añade cloruro de magnesio (MgCl2)para que al disociarse se libere magnesio (con carga +2).
- Una solución tampón capaz de regular el pH, es decir, las condiciones de acidez o basicidad, de nuestra PCR. Esto es muy importante, porque los cambios en el pH de la disolución pueden alterar los resultados de nuestra PCR o evitar que se produzca
Las etapas de cada ciclo son:
- DESNATURALIZACIÓN. Entre 90 ºC y 95 ºC se rompen los enlaces que crean las bases nitrogenadas entre las dos cadenas y se pueden separar sus dos hebras.
- HIBRIDACIÓN. Bajando la temperatura a entre 50 ºC y 65 ºC se permite que las hebras simples de ADN se agreguen con el material genético extra (los cebadores). El objetivo es encerrar entre dos cebadores la secuencia de ADN que se quiere amplificar.
- ELONGACIÓN. Volviendo a subir la temperatura entre 72 ºC y 75 ºC se activa la ADN polimerasa y, gracias a los cebadores, esta enzima puede comenzar a reconstruir las hebras complementarias y copiar solo la secuencias comprendidas entre dos cebadores. Al final del ciclo, por cada cadena simple se obtiene una cadena doble, de modo que en cada ciclo se duplica el número de secuencias de ADN.
Existe una variante de la PCR, la PCR en tiempo real, que permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos de la amplificación en un termociclador provisto de sensores de fluorescencia. En este caso, la acumulación de ADN amplificado es detectado y cuantificado a medida que la reacción avanza, es decir, : «en tiempo real». Para ello es necesario añadir una molécula fluorescente que se asocia al ADN amplificado, de modo que el aumento de esta fluorescencia es proporcional al incremento de la cantidad de moléculas de ADN amplificadas en la reacción [6].
La historia de un descubrimiento que permitió el nacimiento de la genómica
La técnica de la PCR fue inventada en 1985 por el bioquímico Kary B. Mullis, que en 1993 recibió el premio Nobel de Química por este descubrimiento (compartido con Michael Smith por sus trabajos sobre procedimientos de mutagénesis dirigida).
La idea de Mullis era fabricar millones de copias de un fragmento de ADN de forma rápida y sencilla, pero esto requería encontrar una ADN polimerasa capaz de resistir a las elevadas temperaturas (94 ºC) que eran necesarias para desdoblar las hebras de la doble hélice del ADN. Fueron dos compañeros de Mullis, Susanne Stoffel y David H. Gelfand, quienes la encontraron en la bacteria Thermus aquaticus que había descubierto el microbiólogo Thomas Brock. Otro microbiólogo, Randy Siki demostró que esta ADN polimerasa Taq era idónea para replicar ADN en el proceso de la PCR, porque podía soportar altas temperaturas sin perder su funcionalidad [3] [4]. La PCR es una técnica que repite en bucle un ciclo de procesos de desnaturalización (separación de las cadenas de ADN), hibridación con unos cebadores (secuencias de nucleótidos que permiten iniciar la acción de la polimerasa Taq) y elongación, de modo que en cada ciclo se duplica el número de copias de ADN. En 31 ciclos se generan:
¡¡¡¡¡ 2 147 483 648 copias !!!!!
Pero, ¿para qué se usa la PCR?
A estas alturas seguro que estaréis pensando que para qué queremos tener tantas copias de un fragmento de material genético de una célula, una bacteria o un virus. Pues bien, la PCR es una técnica estrella para todo investigador que trabaje con moléculas de ADN. ¿Sabíais que hoy en día es la técnica que permite obtener grandes cantidades de insulina sintética? Esto se logra retrotranscribiendo el ARN mensajero específico de la insulina y amplificándolo con PCR para después clonarlo en un vector de expresión que permita producir esta proteína en gran cantidad [5].
La reacción en cadena de la polimerasa se ha popularizado en el lenguaje coloquial a raíz de la pandemia de COVID-19, pero su uso en los laboratorios es muy habitual desde hace muchos años, para aplicaciones variadísimas, que van desde la secuenciación del ADN hasta la generación de perfiles de ADN forense a partir de muestras genéticas, pasando por la identificación de patógenos gracias a la detección de la ausencia o presencia de sus genes en el organismo infectado.
Entre otras cosas, permite preparar fragmentos de ADN para su clonación en plásmidos bacterianos o virus para utilizarlos como vectores, paso imprescindible en el desarrollo de terapias génicas. Además, muchos diagnósticos clínicos han dejado de requerir largos procesos de cultivos bacterianos y pruebas bioquímicas, porque ahora es más rápido y sencillo amplificar las secuencias genéticas específicas gracias a la PCR. Los beneficios de la amplificación
genética se extienden al diagnóstico de cientos de
enfermedades hereditarias o para identificar patógenos (como el coronavirus causante de la COVID-19). También es una técnica importantísima en las pruebas de paternidad y en los análisis forenses de la policía científica.
En el Instituto Cajal, la Unidad de Biología Molecular y Celular (BMC) proporciona tanto apoyo a los investigadores, sobre todo en cuestiones de genotipado y PCR a tiempo real, como el apoyo técnico para sacar el máximo rendimiento de los equipos y materiales a disposición de los neurocientíficos.
Seguro que os habéis quedado con ganas de saber más. Pinchando aquí tenéis un vídeo de nuestros compañeros del Centro de Biología Molecular (CBM), un centro mixto CSIC-Universidad Autónoma de Madrid. Lo prepararon para la Semana de la Ciencia de 2021 y es un buen ejemplo de aplicación práctica de la PCR a la detección de enfermedades en el hombre con el caso de las pruebas para la COVID-19. Con esta entrada del comodín del palo de Bastos terminamos de publicar las 44 cartas de la Neurobaraja. La próxima semana te diremos cómo puedes imprimirla y jugar. Pero mientras, SI TE HA PICADO LA CURIOSIDAD Y QUIERES SEGUIR INVESTIGANDO POR TU CUENTA, aquí tienes algunos enlaces interesantes:
NOTAS Y FUENTES
[1] Existen algunos virus cuyo ADN no es de doble cadena, sino monocatenario. Estos virus hacen la copia que falta para reconstruir la doble hélice de ADN gracias a la maquinaria celular de las células que infectan.
[2] La PCR solo funciona con fragmentos de ADN. Entonces, para los casos de organismos cuyo material genético está constituido de ARN, como es el caso de los virus con ARN, es necesario añadir un paso previo a la técnica: la RETROTRANSCRIPCIÓN, que permite hacer una copia de ADN de doble cadena a partir de la cadena simple del fragmento de ARN. Y será con esta copia de ADN con la que se podrá llevar a cabo la PCR.
[3] SADURNÍ, J. M. (2020). Un Nobel excéntrico. Kary Banks Mullis, la historia del creador de la PCR. Historia, National Geographic https://historia.nationalgeographic.com.es/a/kary-banks-mullis-excentricidad-genio_15910
[4] CERNA CORTES, J., CERNA CORTES, J. F., GUAPILLO VARGAS, M.R.B. (2004). Taq polimerasa. De los géiseres a la ciencia. Temas de Ciencia y Tecnología vol. 18 número 54 septiembre - diciembre 2014 pp. 52 - 57. https://mixteca.utm.mx/edi_anteriores/temas54/T54_2Notas2-Taq%20polimerasa%20-%20De%20los%20geisers%20a%20la%20ciencia.pdf
[5] GARCÍA, RB., MONTES, HM., RAMOS, RE., ARIZA. CA.,
PÉREZ, VJ., GÓMEZ, GO., CALVA, CG. (2010).
Clonación del cDNA del gen de la insulina humana en raíces aéreas de Brassica oleracea
var italica (brócoli). Revista CENIC. Ciencias
Biológicas. Vol. 41. 1-9 https://doaj.org/article/33b5d8a6c69a43808c18e0d6e3f4f616
[6] PCR en tiempo real. Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México https://quimica.unam.mx/investigacion/servicios-para-la-investigacion/usaii/pcr-en-tiempo-real/
OTROS VÍDEOS
Eugenia, del Canal Mitocondria, explica en qué consiste la PCR y el papel del termociclador https://www.youtube.com/watch?v=NZ5XNjOBptc&t=571s
Crisal, del Canal Un Profesor.https://youtu.be/4WdgrcOUn84?t=91
Canal Nutrimente: PCR: reacción en cadena de la polimerasa (teórico y práctico) https://www.youtube.com/watch?v=mpRy8CSAISs (ver hasta el minuto 05:41)
Carlos Cordón, del Instituto de Biología Molecular del CSIC explica en el Canal We Sapiens el proceso PCR + electroforesis de control https://www.youtube.com/watch?v=whJTMyyV7gU
