La REACCIÓN en CADENA de la POLIMERASA, o PCR por sus siglas inglesas, era una técnica desconocida para los no especialistas en bioquímica o biomedicina hasta que la epidemia del SARS CoV-2 la puso en boca de todos. Pero la PCR no solo sirve para saber si estamos o no infectados por el coronavirus que provoca la COVID-19, porque es una técnica potentísima. Gracias al termociclador, que permite la magia del trabajo de la enzima ADN polimerasa, la PCR desnaturaliza, hibrida y elonga para replicar el mínimo  fragmento de material genético del organismo que queramos estudiar. 

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR por sus siglas inglesas (Polymerase Chain Reaction), es una técnica utilizada en biología molecular que permite conseguir en poco tiempo una gran cantidad de copias de un fragmento de ADN, partiendo de una cantidad ínfima de esta biomolécula.

El ADN es uno de los dos tipos que existen de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos son el nombre que reciben las biomoléculas que guardan la codificación genética de cualquier organismo vivo: son el «manual de instrucciones» donde, con un código de cinco bases (adenosina , citosina, guanosina, timina y uracilo) se «escriben» y especifican las características que tendrá el ser vivo. Pueden ser de dos tipos: 

• Ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena [1] y característico de animales (incluidos los seres humanos), vegetales, bacterias y algunos virus (como el de la hepatitis B o el papiloma humano)
• Ácido ribonucleico (ARN) de cadena simple y característico de ciertos virus (como el famoso SARS CoV-2 que provoca la COVID-19, entre otros muchos)

adaptado de https://www.youtube.com/watch?v=xWrxSV83b1g

Cuando las células de un organismo vivo se dividen, su material genético debe duplicarse de modo que cada célula hija herede una copia idéntica del material genético de la célula madre. Este proceso se denomina mitosis.  

Para replicar el material genético y obtener dos copias idénticas, los seres vivos cuentan con la actividad enzimática de unas moléculas muy particulares: las ADN polimerasas.  La técnica de la PCR se basa en esta actividad enzimática que sucede de forma natural en las células vivas. Como ocurre in vivo, in vitro se emplean ADN polimerasas termoestables (resistentes a temperaturas altas) capaces de «fotocopiar» un fragmento de ADN del que deseamos obtener una gran cantidad de copias igualitas. 

Descripción de la técnica

La PCR consiste en la repetición de un ciclo integrador de tres etapas, cada una de las cuales se caracteriza por una temperatura y una duración específica. 

Por eso, para llevar a cabo una PCR es imprescindible regular perfectamente las condiciones de temperatura en la que se producirán las sucesivas etapas y establecer con precisión la duración de cada una de ellas. Estas son las funciones del TERMOCICLADOR, que gracias a la posibilidad de programar la modificación de la temperatura de la solución en varias ocasiones y sus tiempos,  permite realizar esta técnica en muchísimo menos tiempo, ya que para realizarla, se debe modificar la temperatura de la solución en varias ocasiones.

Además del termociclador, para llevar a cabo una PCR necesitamos los siguientes elementos: 

• El  ADN molde o fragmento de ADN que queremos amplificar mediante la PCR. 
• Nucleótidos (desoxirribonucleótidos-trifosfato): se trata de los cuatro tipos de bases nitrogenadas que forman el armazón del ADN (adenina, guanina, citosina y timina). 
• Cebadores (en inglés, primers). Se trata de oligonucleótidos (secuencias cortas de ADN con entre 15 y 30 nucleótidos) que se unen a la molécula de ADN molde y sirven como punto de inicio para que la Taq polimerasa comience la síntesis de ADN. En la PCR necesitamos dos cebadores, cada uno complementario a una cadena del ADN que buscamos amplificar (en el extremo 3'). Son los que acotarán la región del ADN que se va a amplificar. 
• ADN polimerasas: las reinas de esta técnica bioquímica. En la PCR se pueden utilizar diferentes ADN polimerasas, obtenidas de varios organismos. Sin embargo, la más efectiva y resistente a altas temperaturas procede de una bacteria y se llama Polimerasa Taq. 
• Iones divalentes de magnesio. Se emplean como cofactores de la polimerasa. Estos cationes son esenciales para la función de la ADN polimerasa. Normalmente se añade cloruro de magnesio (MgCl2)para que al disociarse se libere magnesio (con carga +2). 
• Una solución tampón capaz de regular el pH, es decir, las condiciones de acidez o basicidad, de nuestra PCR. Esto es muy importante, porque los cambios en el pH de la disolución pueden alterar los resultados de nuestra PCR o evitar que se produzca

Las etapas de cada ciclo son: 

Existe una variante de la PCR, la PCR en tiempo real, que permite medir la tasa de generación de uno o más productos específicos de la amplificación en un termociclador provisto de sensores de fluorescencia. En este caso, la acumulación de ADN amplificado es detectado y cuantificado a medida que la reacción avanza, es decir, : «en tiempo real». Para ello es necesario añadir una molécula fluorescente que se asocia al ADN amplificado, de modo que el aumento de esta fluorescencia es  proporcional al incremento de la cantidad de moléculas de ADN amplificadas en la reacción [6]. 

La historia de un descubrimiento que permitió el nacimiento de la genómica

La técnica de la PCR fue inventada en 1985 por el bioquímico Kary B. Mullis, que en 1993 recibió el premio Nobel de Química por este descubrimiento (compartido con Michael Smith por sus trabajos sobre procedimientos de mutagénesis dirigida).

La idea de Mullis era fabricar millones de copias de un fragmento de ADN de forma rápida y sencilla, pero esto requería encontrar una ADN polimerasa capaz de resistir a las elevadas temperaturas (94 ºC) que eran necesarias para desdoblar las hebras de la doble hélice del ADN. Fueron dos compañeros de Mullis, Susanne Stoffel y David H. Gelfand, quienes la encontraron en la bacteria Thermus aquaticus que había descubierto el microbiólogo Thomas Brock. Otro microbiólogo, Randy Siki demostró que esta ADN polimerasa Taq era idónea para replicar ADN en el proceso de la PCR, porque podía soportar altas temperaturas sin perder su funcionalidad [3] [4].  La PCR es una técnica que repite en bucle un ciclo de procesos de desnaturalización (separación de las cadenas de ADN), hibridación con unos cebadores (secuencias de nucleótidos que permiten iniciar la acción de la polimerasa Taq) y elongación, de modo que en cada ciclo se duplica el número de copias de ADN. En 31 ciclos se generan:

¡¡¡¡¡   2 147 483 648 copias  !!!!!

Pero, ¿para qué se usa la PCR?

A estas alturas seguro que estaréis pensando que para qué queremos tener tantas copias de un fragmento de material genético de una célula, una bacteria o un virus. Pues bien, la PCR es una técnica estrella para todo investigador que trabaje con moléculas de ADN. ¿Sabíais que hoy en día es la técnica que permite obtener grandes cantidades de insulina sintética? Esto se logra retrotranscribiendo el ARN mensajero específico de la insulina y amplificándolo con PCR para después clonarlo en un vector de expresión que permita producir esta proteína en gran cantidad [5]. 

La reacción en cadena de la polimerasa se ha popularizado en el lenguaje coloquial a raíz de la pandemia de COVID-19, pero su uso en los laboratorios es muy habitual desde hace muchos años, para aplicaciones variadísimas, que van desde la secuenciación del ADN hasta la generación de perfiles de ADN forense a partir de muestras genéticas, pasando por la identificación de patógenos gracias a la detección de la ausencia o presencia de sus genes en el organismo infectado.

Entre otras cosas, permite preparar fragmentos de ADN para su clonación en plásmidos bacterianos o virus para utilizarlos como vectores, paso imprescindible en el desarrollo de terapias génicas. Además, muchos diagnósticos clínicos han dejado de requerir largos procesos de cultivos bacterianos y pruebas bioquímicas, porque ahora es más rápido y sencillo amplificar las secuencias genéticas específicas gracias a la PCR. Los beneficios de la amplificación genética se extienden al diagnóstico de cientos de enfermedades hereditarias o para identificar patógenos (como el coronavirus causante de la COVID-19). También es una técnica importantísima en las pruebas de paternidad y en los análisis forenses de la policía científica. 

En el Instituto Cajal, la Unidad de Biología Molecular y Celular (BMC) proporciona tanto apoyo a los investigadores, sobre todo en cuestiones de genotipado y PCR a tiempo real, como el apoyo técnico para sacar el máximo rendimiento de los equipos y materiales a disposición de los neurocientíficos.

Con esta entrada del comodín del palo de Bastos terminamos de publicar las 44 cartas de la Neurobaraja. La próxima semana te diremos cómo puedes imprimirla y jugar. Pero mientras, SI TE HA PICADO LA CURIOSIDAD Y QUIERES SEGUIR INVESTIGANDO POR TU CUENTA, aquí tienes algunos enlaces interesantes:

NOTAS Y FUENTES 

[1] Existen algunos virus cuyo ADN no es de doble cadena, sino monocatenario. Estos virus hacen la copia que falta para reconstruir la doble hélice de ADN gracias a la maquinaria celular de las células que infectan. 

[2] La PCR solo funciona con fragmentos de ADN. Entonces, para los casos de organismos cuyo material genético está constituido de ARN, como es el caso de los virus con ARN, es necesario añadir un paso previo a la técnica: la RETROTRANSCRIPCIÓN, que permite hacer una copia de ADN de doble cadena a partir de la cadena simple del fragmento de ARN. Y será con esta copia de ADN con la que se podrá llevar a cabo la PCR.

[3] SADURNÍ, J. M. (2020). Un Nobel excéntrico. Kary Banks Mullis, la historia del creador de la PCR. Historia, National Geographic                  https://historia.nationalgeographic.com.es/a/kary-banks-mullis-excentricidad-genio_15910

[4] CERNA CORTES, J., CERNA CORTES, J. F., GUAPILLO VARGAS, M.R.B. (2004). Taq polimerasa. De los géiseres a la ciencia. Temas de Ciencia y Tecnología vol. 18 número 54 septiembre - diciembre 2014 pp. 52 - 57.                                                                                              https://mixteca.utm.mx/edi_anteriores/temas54/T54_2Notas2-Taq%20polimerasa%20-%20De%20los%20geisers%20a%20la%20ciencia.pdf

[5] GARCÍA, RB., MONTES, HM., RAMOS, RE., ARIZA. CA., PÉREZ, VJ., GÓMEZ, GO., CALVA, CG. (2010). Clonación del cDNA del gen de la insulina humana en raíces aéreas de Brassica oleracea var italica (brócoli). Revista CENIC. Ciencias Biológicas. Vol. 41. 1-9 https://doaj.org/article/33b5d8a6c69a43808c18e0d6e3f4f616

[6] PCR en tiempo real. Facultad de Química de la Universidad Nacional Autónoma de México https://quimica.unam.mx/investigacion/servicios-para-la-investigacion/usaii/pcr-en-tiempo-real/

OTROS VÍDEOS

Eugenia, del Canal Mitocondria, explica en qué consiste la PCR y el papel del termociclador https://www.youtube.com/watch?v=NZ5XNjOBptc&t=571s

Crisal, del Canal Un Profesor.https://youtu.be/4WdgrcOUn84?t=91

Canal Nutrimente: PCR: reacción en cadena de la polimerasa (teórico y práctico) https://www.youtube.com/watch?v=mpRy8CSAISs (ver hasta el minuto 05:41)

Carlos Cordón, del Instituto de Biología Molecular del CSIC explica en  el Canal We Sapiens el proceso PCR + electroforesis de control https://www.youtube.com/watch?v=whJTMyyV7gU

La CITOMETRÍA DE FLUJO vale su peso en oro porque permite analizar muy rápidamente (un millón de células en unos 10 minutos😮) las células presentes en una muestra. Además de contarlas,  permite conocer una serie de características relacionadas con el tamaño y la complejidad interna de cada una de ellas. Por la cantidad de aplicaciones que tiene en el campo de la neurociencia, el citómetro de flujo es un equipo indispensable para continuar avanzando en el conocimiento del sistema nervioso.

El citómetro de flujo es uno de los equipos estrella en cualquier laboratorio de  neurociencia, porque incorpora una tecnología que permite medir y cuantificar propiedades fenotípicas, bioquímicas o moleculares tanto de células individuales como de otras partículas, biológicas o no. Una variante común de esta técnica permite además separar físicamente células o partículas según sus propiedades, lo que permite, por ejemplo, purificar poblaciones de interés.

• Muy rápida: analiza y cuenta decenas de millares de células o partículas en pocos segundos (un promedio de más de 2000 por segundo [2]).  
• Muy potente: analiza simultáneamente más de una decena de parámetros cualitativos y cuantitativos (intrínsecos y extrínsecos [3]) de cada una de las células o partículas presentes en una población celular heterogénea. e cualquier célula o partícula suspendida desde 0,2 hasta 150 micras
• Muy versátil: además de contar las células, permite obtener información relacionada con el tamaño y la complejidad interna de cada célula. Utilizando anticuerpos con un marcador fluorescente también se conoce el grado de expresión de determinadas proteínas de la superficie celular. 

• Teniendo en cuenta que la citometría de flujo es una tecnología compleja que se basa en la combinación de diferentes principios físicos, químicos, eléctricos y ópticos, es difícil establecer su punto de partida. Sin embargo, se considera que el primer prototipo de  citómetro de flujo fue el dispositivo fotoeléctrico diseñado en 1934 por el bacteriólogo Andrew Moldovan para contar células individuales que se movían a través de un tubo capilar iluminado colocado en una platina de microscopio. Aunque el diseño se publicó en la revista Science, el dispositivo nunca llegó a construirse.
• Durante la Segunda Guerra Mundial, el interés del ejército de EE. UU. por desarrollar un sistema que detectara rápidamente agentes biológicos bacterianos marcó otro hito importante en la historia de la citometría de flujo. Fueron Gucker y O’Konsi quienes, en  1947, desarrollaron el primer citómetro para la detección de bacterias y esporas en aerosoles utilizando un faro Ford como fuente de iluminación y un tubo fotomultiplicador para amplificar la señal de luz incandescente.
• Algunos años más tarde, en 1953, el ingeniero eléctrico Wallace H. Coulter enunció el llamado «principio de Coulter», que viene a decir que las partículas que pasan a través de un orificio en presencia de una corriente eléctrica producen un cambio en la impedancia que es proporcional al volumen de la partícula.

• Fuente: https://es.wikipedia.org/wiki/Principio_Coulter#/media/Archivo:Coulter_geometries.png

• Mack Fulwyler inventó en 1963 el primer citómetro separador (o cell sorter) en el Laboratorio Nacional de los Álamos (EE. UU.) al combinar el análisis automatizado del tamaño celular con una nueva tecnología de impresoras de chorro de inyección de tinta.
• En 1967, Louis Kametsky (de IBM) diseñó un dispositivo espectrofotométrico para clasificar células cervicales basándose en múltiples propiedades espectrofotométricas a velocidades superiores a 500 células por segundo (los citómetros actuales pueden trabajar a velocidades de 70000 eventos por segundo).
• En 1978 Wolfgang Göde desarrolló el primer citómetro de flujo basado en fluorescencia en la Universidad de Münster (Alemania). A principios de la década de los 70 Howard Shapiro y Block Instruments diseñaron una serie de citómetros de flujo con un sistema multihaz de láseres que permitían medir múltiples fluorescencias de forma simultánea. Shapiro publicó la que sigue siendo una de las «biblias» de la citometría:  «Practical Flow Cytometry».
• De forma paralela, un grupo de la Universidad de Standford (EE. UU.) dirigido por Len Herzenberg desarrolló y patentó el primer citómetro separador activado por fluorescencia (FACS) a finales de los años 1960. Este nuevo método para separar células individuales en función de sus características específicas de dispersión de luz y fluorescencia revolucionó la investigación en inmunología, hematología y oncología. 
• En 1974 Becton Dickinson (ahora BD Biosciences) obtuvo la licencia de la tecnología FACS de la Universidad de Stanford e introdujo el primer citómetro FACS comercial. 
• No podemos olvidar lo que supuso para el desarrollo exponencial de la citometría de flujo en la investigación biomédica el trabajo de George Köhler y César Milstein, que en 1975 fusionaron por primera vez linfocitos con células de un mieloma para obtener un hibridoma una línea celular inmortal capaz de producir anticuerpos específicos (monoclonales). Un trabajo por el que recibieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1984, junto a Niels K. Jerne. 

• Principios de funcionamiento

• Básicamente, el citómetro de flujo mide las propiedades de absorción y dispersión de la luz por la célula o partícula subcelular, así como la fluorescencia emitida por los fluorocromos unidos a componentes celulares de interés, e inducida por una iluminación apropiada. La mayor o menor dispersión de luz según diferentes ángulos permite cuantificar el tamaño relativo y la complejidad (morfología de la superficie, granulosidad interna) de la célula.

• La teoría de fluidos es la que fundamenta el sistema hidrodinámico que crea el flujo laminar que obliga a las células o partículas a fluir en una fila única en el centro de la corriente (enfoque hidrodinámico) hasta conducirlas al punto de interrogación, donde el láser las excitará para generar una variedad de potenciales de excitación.

• Llegadas al punto de interrogación, el conteo de células o partículas se basa en el ya mencionado principio de Coulter.

• Componentes básicos de un citómetro de flujo 

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• El SISTEMA DE FLUIDOS lleva las células o partículas hasta el punto de interrogación. Consta de una cámara de flujo, donde se orienta el fluir de las células o partículas para conseguir que pasen de una en una por el llamado punto de interrogación.
• Algunos citómetros incorporan una unidad de separación (o módulo cell sorter), de modo que además de analizar las células, permiten separar físicamente subpoblaciones de una muestra en función de sus parámetros morfológicos y de fluorescencia. En ocasiones la separación es inmunomagnética (se revisten microesferas magnetizables con anticuerpos monoclonales que marcan las células que se desea analizar).

• Separación inmunomagnética (adaptado de inmunosalud.net)

  
  
• En el Instituto Cajal esto nos permite, por ejemplo, separar en un tubo las neuronas que expresan orexina del hipocampo de un ratón aislándolas del resto de células del cerebro del animal. Esto, unido al desarrollo de las ciencias ómicas y de los estudios en «célula única» (single cell) hacen que el módulo de separación y en concreto la tecnología de célula única sea una aplicación puntera dentro del campo de la neurociencia.

• El SISTEMA ÓPTICO ilumina las células o partículas y gracias al conjunto de filtros y espejos la luz emitida llega a los detectores. La fuente de luz es generalmente un rayo láser (luz altamente direccionada, monocromática, coherente e intensa que se concentra en un haz estrecho). Actualmente suele ser un láser de ion argón.  El sistema óptico de excitación se completa con lentes, espejos y filtros que enfocan el haz de luz para iluminar la muestra y descomponer la emisión de fluorescencia en sus componentes individuales. 

• • El SISTEMA ELECTRÓNICO se encarga de registrar y procesar la información gracias a una serie de fotomultiplicadores y convertidores analógicos/digitales que detectan y convierten las señales luminosas en impulsos eléctricos, y estos en señales digitales. Un ordenador asegura el control instrumental del citómetro de flujo y el almacenamiento y análisis de los datos en tiempo real o en modo de matriz de datos. 
  • Los datos generados por los citómetros de flujo pueden representarse en relación a una variable, en forma de histograma, o en gráficos de puntos (dot-plot) de dos dimensiones y dos o más variables, o incluso en gráficos tridimensionales. 
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  Perspectivas de futuro

  CITOMETRÍA DE FLUJO ESPECTRAL

  En lugar de evaluar la emisión máxima de cada fluoróforo, la citometría de flujo espectral utiliza una serie de detectores para medir el espectro completo, que posteriormente se separará mediante un algoritmo matemático. Esto permite usar fluoróforos con espectros muy similares casi superpuestos para aumentar el número de parámetros analizados en cada experimento.

  CITOMETRÍA CLÁSICA POLICROMÁTICA

  FUENTE: http://cyto.purdue.edu/en https://www.future-science.com/doi/10.2144/btn-2022-0005

  
  a) Cada detector recoge únicamente el máximo de emisión del fluoróforo.

  b) El propio fenómeno físico de la fluorescencia hace que los espectros de emisión se superpongan y la señal se «cuele» en otros detectores

  c) Solo se recoge la señal de fluorescencia de la longitud de onda determinada por el filtro que estemos utilizando, de modo que el resto de la señal se pierde.

  CITOMETRÍA ESPECTRAL

  Recoge y analiza la fluorescencia emitida por el fluoróforo a lo largo de todo el espectro. Esta marca espectral es única (comparable a una huella digital en un ser humano) e identifica a un único fluoróforo. Actualmente solo se pueden analizar en un citómetro espectral hasta 20 colores, pero es probable que en pocos años evolucionen para permitirnos medir simultáneamente varios cientos de parámetros en cada célula.

  FUENTE: http://cyto.purdue.edu/en https://www.future-science.com/doi/10.2144/btn-2022-0005

  
  CITOMETRÍA DE MASAS

  Es una combinación de la citometría de flujo con la espectrometría de masas. En lugar de anticuerpos marcados con fluoróforos, esta técnica utiliza anticuerpos marcados con iones de metales pesados.

  CITOMETRÍA DE IMÁGENES 

  Esta técnica combina la citometría con la microscopía de fluorescencia y permite evaluar la morfología de las células (es una de las grandes limitaciones de la citometría clásica) y también permite visualizar la coexpresión de proteínas, la unión celular, la translocación celular de proteínas, las sinapsis de células inmunitarias…Como muestra la imagen, simplemente pasando la sangre por el citómetro —sin utilizar marcadores fluorescentes—, podemos diferenciar entre linfocitos, monocitos y granulocitos analizando su tamaño y complejidad.

  Adaptado de MIT y EMBL

  
  

  
  Estrategia de «gating» para analizar la proporción de linfocitos CD8 efectores de memoria con relación a otras subpoblaciones linfocitarias en el cerebro de ratón.

  
  Aplicaciones de la citometría de flujo
  
  
  INMUNOFENOTIPADO = identificar y cuantificar de distintas poblaciones celulares según la distinta expresión de ciertos marcadores de superficie o intracelulares
•      Aplicación en diagnóstico y tratamiento de cáncer
•      Diagnóstico y seguimiento de inmunodeficiencias (por ejemplo enfermos VIH)
•      Terapia celular y trasplante (estudios de compatibilidad para elección del donante adecuado)


MEDIDA DE LA VIABILIDAD CELULAR = diferenciar las células vivas de las muertas


ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD CELULAR

•      Medida de la capacidad fagocítica de una célula
•      Medida de la apoptosis (= muerte celular programada de la célula que juega un papel importante en la prevención del cáncer)
•      Determinación de la movilización de calcio
•      Determinación de especies reactivas del oxígeno                                                              
ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR = permiten diferenciar las células activas de las células en reposo                                                                                                                              
ESTUDIO DEL CICLO CELULAR = el marcado fluorescente del ADN permite establecer en qué fase del ciclo de replicación se encuentra la célula                                                        
ESTIMACIÓN DEL TAMAÑO DEL GENOMA (conjunto de genes)                                            
SEPARACIÓN DE CÉLULAS = los citómetros de flujo separadores utilizan propiedades electrostáticas para separar por tipos las células de interés presentes en la muestra      
IDENTIFICACIÓN Y CONTAJE DE BACTERIAS


¿Qué hacemos en la Unidad de Citometría del Instituto Cajal?
• Identificar poblaciones celulares mediante marcaje de antígenos intra o extracelulares
• Estudiar la viabilidad celular mediante la utilización de colorantes vitales
• Medir la apoptosis celular mediante la utilización de distintas técnicas (Anexina-V/Ioduro de Propidio, TUNEL, determinación del potencial de membrana mitocondrial, detección de pico sub-G0, etc.)
• Estudiar el estrés oxidativo mediante el empleo de sondas fluorescentes
• Estudiar las distintas fases del ciclo celular
• Determinar el índice proliferativo celular mediante la utilización de análogos de nucleósidos marcados (BrdU)
• Estudiar la expresión génica guiados por proteínas fluorescentes (GFP, YFP…)
• Estudiar la señalización intracelular
• Cuantificar las citoquinas y otras proteínas solubles
• Estudiar la movilización de Ca²⁺ intracelular
• Separación celular (sorting)

Ya lo veis, la citometría de flujo tiene un futuro tan resplandeciente como el palo de oros que representa, principalmente porque es la única tecnología que permite análisis globales y multiparamétricos de células individuales.

¿TE HA PICADO LA CURIOSIDAD Y QUIERES SABER MÁS?

Notas:

[1] El citómetro de flujo del Instituto Cajal analiza células o partículas comprendidas entre 0,5 y 100 micrómetros.

[2] Wikipedia, entrada Citometría de flujo   https://es.wikipedia.org/wiki/Citometr%C3%ADa_de_flujo

[3] Parámetros intrínsecos, como tamaño, superficie, granularidad del interior de la célula, autofluorescencia (una propiedad intrínseca de ciertas moléculas —denominadas fluoróforos— que se caracterizan por la emisión transitoria de luz cuando son estimuladas por una fuente exógena de una longitud de onda más corta —más energética—).

Parámetros extrínsecos, como contenido en y composición de ácidos nucleicos (ADN y ARN), estructura de la cromatina, proteínas, grupos sulfhídricos (-SH), antígenos, lectinas, sitios de unión, componentes del citoesqueleto, estructura de las membranas, actividad enzimática, endocitosis, carga superficial, receptores, calcio libre y ligado, apoptosis, necrosis celular, pH, farmacocinética.

Otras fuentes:

PAUL ROBINSON, J. (2022). Flow cytometry: past and future. Biotechniques Vol. 72, no. 4

https://www.future-science.com/doi/10.2144/btn-2022-0005

El gen curioso. Entrada Citometría de flujo.  https://www.elgencurioso.com/diccionario/citometria-de-flujo/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3279584/

http://www.cyto.purdue.edu/

Vídeos: 

Flow Cytometry Animation (EN INGLÉS), MIT https://www.youtube.com/watch?v=EQXPJ7eeesQ

Rodrigo Blanco y Dr. Corell Almuzara para la Facultad de Medicina de la Universidad de Valladolid https://www.youtube.com/watch?v=gEdZvuDrWo4

Paula Reyes https://www.youtube.com/watch?v=RfDMmxS8Zik

Malte Paulsen, Flow Cytometry introduction  https://www.youtube.com/watch?v=W1BFeiDwqnk